Influence de la méthylation de l'ADN sur la cohésion chez les bactéries // Influence of DNA methylation on cohesion in bacteria

Chez les eucaryotes, les loci nouvellement répliqués sont maintenus ensemble jusqu'à l'anaphase. Ce processus est assuré par la cohésine, un complexe en forme d'anneau contenant deux protéines de maintenance structurelle des chromosomes (SMC). Au contraire, réplication et ségrégation sont simultanées chez les bactéries. Les chromosomes bactériens contiennent une seule origine de réplication bidirectionnelle, oriC, qui définit deux bras de réplication. Au fur et à mesure que la réplication progresse le long des bras chromosomiques, les loci nouvellement répliqués migrent vers les moitiés opposées de la cellule. Il existe néanmoins un décalage de quelques minutes entre le moment de la réplication d'un locus et la ségrégation des deux copies qui en résultent. À proprement parler, les bactéries n'ont pas d'orthologue des cohésines. Toutefois, par analogie avec les eucaryotes, ce phénomène est appelé cohésion des chromatides sœurs. L'équipe a mis au point une méthode permettant de mesurer la fréquence des contacts entre chromatides sœurs derrière les fourches de réplication à haute résolution sur l'ensemble du génome, HiSC2. Son application à E. coli et Vibrio cholerae a révélé des régions de quelques centaines de kb où la durée de la cohésion était prolongée, y compris la région de l'origine de la réplication. HiSC2 a également montré que la durée de la cohésion variait sur de courtes distances de 1kbp. Une analyse préliminaire suggère une corrélation entre les variations de la durée de cohésion sur de courtes distances et la fréquence locale des sites GATC. Les origines de réplication des chromosomes d'E. coli et de V. cholerae sont fortement enrichies en sites GATC, confortant l'idée que la présence de sites GATC allonge la période de cohésion. Les sites GATC sont méthylés par une Adénine méthylase, DamMT, ce qui suggère que la cohésion chez les bactéries est liée à la méthylation de l'ADN. L'objectif du projet de doctorat est de caractériser la manière dont la méthylation de l'ADN affecte la durée de la cohésion en utilisant E. coli et V. cholerae comme modèles bactériens. Les mécanismes par lesquels la méthylation affecte la période de cohésion seront étudiés en mesurant la cohésion en exploitant la richesse de souches d'E. coli portant des mutations dans des méthylases connues, telles que DamMT, et dans des gènes codant pour des protéines dont on sait que l'activité dépend de la méthylation, telles que SeqA, la protéine de séquestration de l'origine. Le profil de cohésion et le méthylome des mutants seront déterminés en utilisant HiSC2 et le séquençage massif de longs fragments, respectivement. Parallèlement, le profil de fixation des produits des gènes sera déterminé par ChIPseq, et l'effet de chaque mutant sur le cycle de division cellulaire et le cycle de réplication/ségrégation sera caractérisé par cytométrie, microscopie à fluorescence et analyse de la fréquence chaque base du chromosome dans des populations de celluels asynchrones. Certaines des protéines impliquées dans ou affectées par la méthylation de l ADN sont essentielles chez V. cholerae. C'est notamment le cas de DamMT et SeqA. Leur influence sur la cohésion sera suivie en créant des mutants permettant leur déplétion conditionnelle.
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In eukaryotes, newly-replicated loci are held together from the time they exit the replication fork until anaphase. This process is mediated by cohesin, a ring-shaped complex containing two structural maintenance of chromosomes (SMC) proteins. In contrast, replication and segregation are concurrent in bacteria. Bacterial chromosomes contain a single origin of bidirectional replication, oriC, which defines two replication arms. As replication progresses along the chromosomal arms, newly replicated loci migrate to opposite halves of the cell. However, there is a lag of a few minutes between the time of replication of a locus and the segregation of the two resulting copies. Strictly speaking, bacteria lack an ortholog of cohesins. However, by analogy with eukaryotes, this phenomenon is referred to as sister chromatid cohesion. The team developed a method to monitor sister chromatid contacts behind replication forks at a high resolution across the entire genome, HiSC2. Its application to E. coli and Vibrio cholerae revealed regions of a few hundred kb where the duration of cohesion was prolonged, including the origin of replication region. HiSC2 also showed that the duration of cohesion varied over short 1kbp distances. Preliminary analysis suggests a correlation between the variations of the duration of cohesion over short distances and the local frequency of GTAC sites. The replication origins of the E. coli and V. cholerae chromosomes are highly enriched in GATC sites, which could explain the extended cohesion period around those positions. GATC sites are methylated by a DNA adenine methylase, DamMT, suggesting that DNA methylation influences cohesion in bacteria. The aim of the PhD project is to characterise how DNA methylation affects the duration of cohesion using E. coli and V. cholerae as bacterial models. The mechanisms by which methylation affects the cohesion period will be investigated by monitoring cohesion in the wealth of E. coli strains bearing mutations in known methylases, such as DamMT, and in genes encoding for proteins known to depend on methylation for activity, such as SeqA, the origin sequestration protein. The cohesion profile and methylome of the mutants will be determined using HiSC2 and long read sequencing techniques, respectively. In parallel, the binding profile of the wild-type and mutant products will be determined by ChIPseq, and the effect of each mutant on the cell division cycle and the replication/segregation cycle will be characterised by cytometry, fluorescence microscopy and marker frequency analysis. Some of the proteins involved in or affected by methylation are essential in V. cholerae. This is notably the case for DamMT and SeqA. Their influence on cohesion will be monitored by creating mutants that allow their conditional depletion.
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Début de la thèse : 01/10/2025
WEB : https://www.i2bc.paris-saclay.fr/equipe-evolution-and-maintenance-of-circular-chromosomes/

Contrats ED : Programme blanc GS-LSaH

Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health

577 Structure et Dynamique des Systèmes Vivants

Les potentiels candidats doivent être très motivés et capable de travailler de manière indépendante et en collaboration. Les candidats doivent avoir de solides connaissances en microbiologie moléculaire, en génomique microbienne et/ou en biologie cellulaire microbienne (y compris la microscopie). Une expérience de recherche dans un domaine connexe est un atout majeur, et des compétences en informatique (traitement des données de séquençage de nouvelle génération, programmation en Python/MatLab) sont également appréciées. Une bonne maîtrise de l'anglais pour les communications scientifiques et ordinaires est essentielle.
Prospective students should be highly motivated and able to work independently as well as collaboratively. Candidates should have strong background in molecular microbiology, microbial genomics and/or microbial cell biology (including microscopy). Previous research experience in related research topic is a big plus, and capacity in informatics (treatment of next generation sequencing data, programming in Python/MatLab) is also welcomed. Decent English skill for scientific and ordinary communications is essential.