Rôle de HlyF dans l'aggravation des symptômes de la colibacillose aviaire // Role of HlyF in the worsening of avian colibacillosis

Contexte:
L'industrie de la volaille est une source cruciale de protéines dans le monde entier. En Asie, plus de 43 millions de tonnes de viande de poulet ont été produites en 2020, dont 35% en Chine. Les E. coli pathogènes aviaires (APEC) sont l'agent principal de la colibacillose aviaire, une maladie des voies respiratoires entraînant des pertes économiques considérables dans les élevages de volaille (Guabiraba et al, 2015). L'un des principaux réservoirs d'APEC est l'intestin du poulet, où l'APEC se réplique avant d'être excrété et disséminé dans l'environnement des poulaillers (Ewers et al., 2009). Ensuite, les poulets sont infectés en inhalant l'APEC provenant de la poussière. Les isolats d'APEC les plus virulents (ex : O78, O1 et O2) possèdent le plasmide de virulence ColV, qui code pour divers gènes associés à la virulence, y compris le marqueur épidémiologique hlyF. Nous avons montré que la présence de hlyF est corrélée avec une meilleure adaptation de la souche d'APEC O78 χ7122 dans un modèle d'infection de poulet (Murase et al., 2016) par un mécanisme encore inconnu. Les bactéries à Gram négatif produisent des vésicules extracellulaires à partir du bourgeonnement de leur membrane externe (OMVs). Nous avons montré que HlyF est une enzyme cytoplasmique qui induit la production d'OMVs (hOMV pour OMVs induites par HlyF) avec une toxicité particulière. Les hOMV bloquent l'autophagie des cellules épithéliales et activent l'inflammasome, entraînant la mort cellulaire (David et al., 2022 ; Goman et al., en révision). De plus, nous avons démontré que les hOMV sont spécifiquement capables de perturber la barrière épithéliale. Aucun de ces phénomènes n'est induit par les OMVs produites par une souche portant un mutant catalytique de l'enzyme HlyF (hmutOMV).
Objectifs:
Nous émettons l'hypothèse que HlyF chez les APEC améliore le passage de l'APEC à travers les organes respiratoires des poulets, conduisant à la colibacillose. L'objectif du projet est d'identifier les mécanismes par lesquels la présence de HlyF influence la physiopathologie de la colibacillose aviaire. Pour répondre à ces objectifs, nous combinerons des techniques de microbiologie moléculaire avec des modèles d'infection in vitro et un modèle de colibacillose chez le poulet. Nous comparerons une souche APECwt avec une souche APEC ∆hlyF et sa souche complémentée. Afin d'identifier le rôle des OMVs dans la physiopathologie de l'APEC, nous infecterons les cellules avec des hOMV ou des hmutOMV au lieu des bactéries.
Méthodes :
• Modèle in vitro de barrière épithéliale
• Immunofluorescence
• Microbiologie moléculaire
• Modèle de colibacillose chez le poulet
• Immunohistologie
Faisabilité:
Le laboratoire possède une vaste expérience dans l'étude de la pathogénie des E. coli. La culture d'APEC et la manipulation génétique sont également bien maîtrisées, ainsi que la purification des OMVs à partir de cultures de E. coli et le modèle in vitro de barrière épithéliale. Notre laboratoire est situé sur le site Inserm de Purpan à Toulouse, avec une plateforme d'imagerie et une plateforme d'histologie directement accessibles sur place. De plus, nous avons déjà une collaboration avec l'école vétérinaire de Toulouse où nous avons développé un modèle de colibacillose chez le poulet qui sera accessible à l'étudiant en thèse.
Résultats attendus et perspectives:
Nous déterminerons les mécanismes par lesquels HlyF serait un déterminant crucial dans l'aggravation de la colibacillose aviaire. De plus, nous distinguerons le rôle des OMVs et de la bactérie entière dans les premiers stades de la maladie. Enfin, nous analyserons l'impact de HlyF sur l'inflammation chez les poulets. Ces résultats sont essentiels pour comprendre la physiopathologie des groupes les plus virulents d'APEC afin de développer des thérapies alternatives aux antibiotiques. Par conséquent, notre projet fournira une base solide de connaissances sur l'APEC pour lutter contre la colibacillose dans l'industrie avicole.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Context:
Poultry industry is a crucial source of protein worldwide. In Asia, no less than 43 million tonnes of chicken meat was produced in 2020, with 35% of the production coming from China (https://www.compassioninfoodbusiness.com/). Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) is the main agent of avian colibacillosis, a respiratory tract disease causing considerable economic losses in poultry husbandries (Guabiraba and Schouler, 2015). One of the main reservoirs of APEC is the chicken intestine, where APEC replicate before being excreted and disseminated in the environment of chicken houses (Ewers et al., 2009). Then, chickens are infected by inhaling APEC from dust. The most virulent APEC isolates (as O78, O1 and O2 strains) harbor the large virulence plasmid ColV, encoding various virulence associated genes including the epidemiological marker hlyF. We showed that hlyF is correlated with the in vivo fitness of the APEC strain O787122 (Murase et al., 2016) by a mechanism still to be determined. Gram-negative bacteria produce extracellular vesicles from budding or their outer membrane (OMVs). We showed that HlyF is a cytoplasmic enzyme not exported in OMVs but inducing the production of OMVs (hOMV for HlyF-induced OMVs) with peculiar toxicity. hOMV block the autophagy of epithelial cells and activate the inflammasome leading to cell death (David et al., 2022; Goman et al., under revision). Also, we demonstrated that hOMV are specifically able to disrupt the epithelial barrier (unpublished data). All these phenotypes are not induced by OMVs produced by a strain with a catalytic mutant of HlyF enzyme (hmutOMV).

Objectives:
We hypothesize that APEC HlyF enhances APEC passage through the respiratory organs of chickens, leading to colibacillosis. The aim of the PhD project is to identify the mechanisms by which the presence of HlyF shapes the pathobiology of colibacillosis. To answer these objectives, we will combine molecular microbiology technics with in vitro models of infection and a chicken model of colibacillosis. We will compare a APECwt versus APEC hlyF and its complemented. To identify the role of OMV in APEC physiopathology, we will infect cells with hOMV or hmutOMV instead of the bacteria.

Methods:
- In vitro model of epithelial barrier
- Immunofluorescence
- Molecular microbiology
- Chicken model of colibacillosis
- Immunohistology

Feasibility:
The host laboratory has extensive experience in studying the pathogeny of Escherichia coli. The cultivation of APEC and the genetic manipulation is also well mastered, as well as the purification of OMVs from E. coli cultures and the in vitro model of epithelial barrier. Our laboratory is located on the Inserm site of Purpan in Toulouse, with an imaging and a histology platform directly accessible on site. Moreover, we already have a collaboration with the vet school in Toulouse where we developed a chicken model of colibacillosis that will be accessible to the PhD student.

Expected results and perspectives:
We intend to decipher the mechanisms by which HlyF may be a crucial determinant in the worsening of colibacillosis in chicken. In addition, we will discriminate the role of OMV and the whole bacteria in the early stage of the disease. Finally, we will analyze the impact of HlyF on the inflammation of chickens. These results are crucial to understand the physiopathology of the most virulent serogroup of APEC in order to develop therapies alternative to antibiotics. Consequently, our project will give a strong basis for knowledge of APEC to fight against colibacillosis in poultry industry.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Début de la thèse : 01/10/2025
WEB : http://www.irsd.fr/equipe-2--pathogenie-et-commensalisme-des-enterobacteries.html

Financement CSC - china scholarship council

Université Toulouse III - Paul Sabatier

151 BSB - Biologie, Santé, Biotechnologies

Formation: master ou équivalent Connaissances en bactériologie, biologie moléculaire. Compétences techniques en bactériologie et biologie moléculaire. Curiosité scientifique, connaissances sur l'intégrité scientifique.
Education: Master degree or equivalent Knowledge in bacteriology, molecular biology. Technical skills in bacteriology and molecular biology. Scientific curiosity, knowledge on scientific integrity.