CAR-FUSION : Optimisation de la persistance fonctionnelle des CAR-T cells par une protéine de fusion modulant l’immunosuppression tumoral et le phénotype mémoire des CAR-T

Notre équipe a développé une expertise clinico-biologique spécifique sur l’étude des leucémies à cellules dendritiques plasmocytoïdes (LpDC) et les LAM (leucémies aiguës myéloïdes) avec excès de pDC (LAM-pDC), qui sont des leucémies très agressives. Nous avons développé un réseau national hémopathies pDC (ROMI, laboratoire médical de référence JORF n°0167 2021) qui a permis de créer une cohorte nationale et des bio collections pour réaliser des travaux de recherche sur ces entités. Ces leucémies sont résistantes aux chimiothérapies, ainsi pour améliorer leur prise en charge, nous avons développé des lymphocytes T (LT) génétiquement modifiés pour exprimer un récepteur chimérique à un antigène (CAR-T, chimeric antigen receptor T cell) dirigé contre CD123 (CAR123) exprimé dans 100% des LpDC et 70% des LAM-pDC. Ce CAR123 a montré sa très bonne efficacité dans différents modèles in vitro et in vivo (Bôle-Richard E et al.,2020 et Fredon M et al.,2024) et devrait être évalué en clinique à moyen terme.

Depuis la « révolution CAR-T », plusieurs CAR-T dirigés contre CD19 sont utilisés en clinique pour le traitement d’hémopathies B. Malgré leur efficacité certaine, en situation de « vraie vie », 40 à 50% des patients rechutent environ à 1 ans (Bachy E et al.,2022), en relation en grande partie avec l’absence de persistance à long terme des CAR-T chez les patients ou l’inhibition des CAR-T par l’environnement immunosuppresseur médullaire de ces leucémies (Schuster SJ et al.,2019).

Les LpDC et LAM-pDC expriment ILT-3 (LILRB4 : leukocyte immunoglobulin like receptor B4), qui est une molécule immunosuppressive capable d’interagir avec les LT via le récepteur LAIR-1, induisant une réduction de leur cytotoxicité (Xiang Z et al.,2024). Des données transcriptomiques obtenues par notre équipe (en cours de publication) montrent que les blastes de LpDC présentent une forte interaction avec les LT via l’interaction ILT-3/LAIR-1. Ces données renforcent l’idée qu’ILT-3 exprimé par les blastes joue un rôle immunosuppresseur sur les LT du micro-environnement leucémique et pourrait inhiber les CAR-T injectés à un patient (qui expriment LAIR-1). Les données de RNAseq suggèrent un impact d’autres couples ligand/récepteur tel que CD274 (PD-L1) / CD80, qui mériteraient d’être explorés par la suite car potentiellement impliqués dans une régulation négative des LT par les pDC tumorales.

En effet les hémopathies à pDC concernent un type cellulaire du système immunitaire (les pDC) impliqué dans la modulation de l’immunité innée et adaptative (Reizis B et al.,2019). Néanmoins, les interactions au sein du microenvironnement leucémique ont été peu étudiées, et plus particulièrement dans les LAM-pDC dont la description est plus récente. Récemment, nos travaux réalisés à partir de données de scRNAseq et  bulk RNAseq, ont mis en évidence dans les LAM-pDC, la participation de nombreux types cellulaires impliqués dans la réponse immunitaire : pDC, cDC (DC conventionnelles type 2), monocytes et des lymphocytes T et B.  Ces différents médiateurs de l’immunité semblent être responsables d’un épuisement lymphocytaire (exhaustion) via l’expression de différents gènes (comme TIGIT, TOX, TNF, GMZK, RUNX3) et d’une polarisation T régulateur, ce qui est suggéré par la modélisation des interactions cellulaires via l’algorithme CellChat, à partir des données de scRNAseq. Ces données sont corroborées par la description dans les leucémies de divers mécanismes d’échappement immunitaire impliquant de nombreux modulateurs immuno-régulateurs (Tomasoni C et al.,2023). Ainsi la caractérisation des cellules du microenvironnement leucémique est un élément clé de l’identification des résistances aux immunothérapies et aux thérapies adoptive.

CD27 (tumor necrosis factor receptor superfamily member 7) est exprimé naturellement sur les LT CD4+ et CD8+, et lors de son activation, il favorise l'activation des LT, leur expansion clonale, leur survie et il permet aux LT de se différencier vers un phénotype mémoire via l’expression de différents facteurs de transcription. Dans le contexte des CAR-T, il a été montré que la costimulation CD27 induit des voies anti apoptotiques, diminue l’expression de PD-1 et ainsi améliore la survie des CAR-T, limite leur épuisement et améliore le contrôle anti tumoral (Chen H et al.,2021;Jaeger-Ruckstuhl  et al.,2024).

Les objectifs de ce travail seront de poursuivre l’évaluation des mécanismes immunosuppresseurs mis en place dans le microenvironnement leucémique des hémopathies à pDC ; de chercher à bloquer ces mécanismes induisant une inhibition des CAR123 ; tout augmentant la production de CAR-T mémoires capables de se maintenir à long terme chez les patients.

Pour ceci, notre équipe souhaite développer de nouvelles stratégies grâce à l’ajout d’un corecepteur qui permettra de réguler l’activation des CAR-T de façon à générer des LT plus résistants à l'épuisement avec également une résistance aux signaux inhibiteurs du microenvironnement leucémique. Ainsi, les CAR-T pourraient conserver leurs fonctions effectrices, même pendant une exposition prolongée à leur antigène in vivo dans un environnement immunosuppresseur.

Ainsi, dans un 1^er temps, pour contourner l’inhibition induite par ILT-3 déjà identifiée, nous développerons un corecepteur contenant une partie extracellulaire reconnaissant ILT-3 associée au domaine intracellulaire de CD27. Ce corécepteur permettra de réorienter les effets inhibiteurs de la signalisation d’ILT-3 sur les LT vers un effet favorable pour le CAR-T  via CD27  (en intracellulaire). Le corécepteur indépendant : ILT3/CD27 (I7) sera ajouté au CAR123 par des méthodes de modifications lentivirales des LT maitrisées au sein du laboratoire. Nous passerons par différentes étapes afin de valider les différentes parties du corécepteur. Nous évaluerons le scFv (single chain Fragment variable) ciblant ILT-3 (séquence obtenue dans les bases de données public) dans la construction du CAR123 qui est connue pour induire une bonne activation des LT. Seul le scFv CD123 sera substitué par le scFv ILT-3 dans le backbone du CAR123, permettant de valider la reconnaissance d’ILT-3 et l’induction de l’activation lymphocytaire. Des mutations ponctuelles des séquences CDR3 des chaines légères et lourdes du scFv pourront être effectuées par la suite, si la reconnaissance d’ILT-3 n’est pas assez forte. Nous ferons de même pour évaluer le module CD27 intracellulaire en le plaçant dans la construction du CAR123, à la place de CD28 (le CAR123 princeps est un CAR-T de 3eme génération possédant les 2 modules de costimulation CD28 et 4.1BB), sans cette fois-ci modifier la partie extracellulaire. Ceci permettra de montrer, que le CD27 inséré modifie l’activation du CAR123 et favorise le développement de CAR-T à phénotype mémoire comparativement au CAR123 princeps. Puis nous développerons le corécepteur I7 complet avec le domaine transmembranaire de CD27 et un hindge extracellulaire CD8a. Le plasmide sera commandé et le surnageant lentiviral sera produit au laboratoire selon les méthodes bien établies au laboratoire. Ce travail sera réalisé à partir de LT primaires sains de donneur de sang (EFS-BFC). Nous évaluerons les rendements de transduction obtenus pour le CAR123 et I7 ainsi que leur stabilité d’expression au fil du temps par CMF. Les différents modèles cellulaires présent au laboratoire exprimant +/- CD123 et +/- ILT-3 (MOLM-13 et CAL-1 : CD123⁺/ILT-3⁺ ; KG-1 : CD123⁺/ILT-3^- ; NALM-6 : CD123^-/ILT-3^-) ainsi que les nombreux PDX (patient derived xenograft) et une bio collection de cellules primaires (réseau ROMI) permettront l’évaluation de la fonctionnalité des CAR123-I7 en comparaison aux CAR123 princeps. L’ensemble des modèles d’évaluation in vitro (profil phénotypique, activation, cytotoxicité, prolifération, sécrétion de cytokines, profil d’épuisement, imagerie IncuCyte®) ainsi que les modèles in vivo (souris immunodéprimées) sont maitrisés.

L’exploration du microenvironnement leucémique débutera par une exploration des données de scRNAseq et de RNAseq sur les populations triées du microenvironnement médullaire leucémique afin de rechercher des signatures suppressives (cellules myéloïdes suppressives (MDSC), d’exhaustion immunitaire). Puis une exploration en CMF des cellules composant le microenvironnement sera réalisée sur des échantillons de moelle de LpDC, de LAM-pDC, de LAM sans excès de pDC et de donneurs sains. Les panels permettront d’identifier les MDSC, les monocytes, les cDC, les pDC, les macrophages (M2 et M1), LT (stades de différenciation, statut sénescent et épuisé), les LT régulateurs, les cellules NK et lymphocytes B (incluant les B régulateurs). En lien avec les résultats obtenus, nous réaliserons des modèles de co-culture à partir de cellules triées, impliquant blastes de LAM-pDC ou de LpDC, +/- les cellules du microenvironnement identifiées précédemment, face à des lymphocytes T et B naïfs afin de montrer sur le plan fonctionnel, l’impact des blastes et cellules suppressives sur leur activation. Le suivi de co-culture sera réalisé par CMF, et évaluera la prolifération lymphocytaire, leur phénotype et leur sécrétion cytokinique.

Ces données devraient permettre d’identifier de nouvelles stratégies de modulation de la réponse antileucémique mis en place par ces différentes populations cellulaires dans ces hémopathies. Les acquisitions biotechnologiques obtenues dans la 1^ère partie de ce projet permettront de créer d’autres corécepteurs adaptés à d’autres mécanismes d’inhibition potentiellement identifiés comme par exemple cibler à la fois les cellules leucémiques et une population cellulaire immunosuppressive particulière.

Université Marie et Louis Pasteur à BESANCON

Laboratoire RIGHT

L’étudiant(e) devra être compétent(e) en immunologie et en hématologie, être familier avec les techniques de cytométrie en flux et de culture cellulaire (lignées, cellules primaires, CFU-assay) ainsi qu’en ingénierie cellulaire (transfection, transduction, clonage). Des connaissances techniques de biologie moléculaire (PCR et RNA-seq, analyse de données), de biochimie (Western-Blot, ELISA), d’analyse statistique et d’expérimentation animale seront appréciées.